Il genoma di E. Tutti questi geni hanno essenzialmente regioni identiche codificanti l'rRNA, ma differiscono nei segmenti intercalati. Come nei batteri, il processo di maturazione include le reazioni di scissione mediate da endo- o esoribonucleasi e reazioni di modificazione dei nucleosidi. Alcuni pre-rRNA contengono introni che devono poi essere eliminati. Esiste una stretta relazione tra trascrizione, maturazione dell'rRNA, e organizzazione dei ribosomi nel nucleolo.

Ciascun complesso comprende le ribonucleasi che scindono gli rRNA precursori, gli enzimi che modificano basi particolari, molti piccoli RNA nucleolari, o snoRNA, che guidano la modificazione dei nucleosidi e alcune reazioni di scissione, e proteine ribosomiali.

Queste reazioni dipendono dai complessi snoRNA-proteine, o snoRNP, ciascuno formato da uno snoRNA e quattro o cinque proteine, tra cui l'enzima che catalizza la modificazione. Esistono due classi di snoRNP caratterizzate da elementi con sequenza conservata, identificati da lettere maiuscole.

Gli snoRNA sono lunghi da 60 a nucleotidi. Molti vengono codificati da sequenze che si trovano all'interno degli introni di altri geni e che vengono cotrascritte insieme ai geni. La restante sequenza conservata dello snoRNA si ripiega in strutture che si legano alle proteine che fanno parte della snoRNP.

In alcuni trascritti di tRNA negli eucarioti sono presenti introni che devono essere rimossi. Questo enzima contiene proteine ed RNA. Nel caso della pseudouridina, la base uracile viene prima rimossa, e poi riattaccata al ribosio in posizione C Alcune di queste basi modificate si trovano in posizioni caratteristiche in tutti i tRNA.

Gli RNA con funzioni speciali vanno incontro a diversi tipi di modificazioni Il numero di classi conosciute di RNA dotati di speciali funzioni va espandendosi rapidamente, insieme con il numero delle funzioni trovate normalmente associate a queste molecole.

Molti di questi RNA vanno incontro a processi di maturazione. Molti snoRNA vengono codificati all'interno di introni di altri geni. Particolari nucleosidi degli snRNA sono soggetti a 11 tipi di modificazioni, mediante O-metilazione in 2' e la conversione dell'uridina in pseudouridina.

Si tratta di RNA non codificanti, lunghi circa 22 nucleotidi, con una sequenza complementare a particolari regioni degli mRNA, che regolano la funzione degli mRNA, tagliandoli, o impedendone la traduzione. I miRNA si trovano negli eucarioti pluricellulari, dai moscerini della frutta, alle piante e ai mammiferi. I trascritti primari dei miRNA pri- miRNA hanno dimensioni molto variabili; alcuni sono codificati negli introni di altri geni e vengono espressi insieme ai geni che li ospitano.

I ribozimi meglio caratterizzati sono gli introni appartenenti al gruppo I capaci di autosplicIng, come l'RNasi P ed i ribozimi a testa di martello. I ribozimi vengono inattivati a temperature superiori alla loro temperatura di fusione e per aggiunta di agenti denaturanti o di oligonucleotidi complementari, che rompono i normali legami idrogeno delle coppie di basi. L'appaiamento promuove l'appropriato allineamento dei leganti che devono essere scissi e riuniti. Il suo meccanismo d'azione si basa sull'orientamento del substrato, sulla catalisi covalente e sulla catalisi da ioni metallici, tutte strategie utilizzate anche dagli enzimi proteici.

La componente proteica apparentemente ha la funzione di stabilizzare l'RNA catalitico o di facilitarne la funzione in vivo. Alcuni virusoidi, piccoli RNA associati ai virus a RNA delle piante, contengono una struttura che catalizza una reazione di autosplicing. Il ribozima a testa di martello, appartiene a questa classe di ribozimi. Esso catalizza l'idrolisi di un legame fosfodiestere interno.

La reazione di splicing che avviene in uno spliceosoma potrebbe basarsi su un centro catalitico formato dagli snRNA U2, U5, e U6. Lo studio degli RNA catalitici ha ampliato l'orizzonte della catalisi in generale e allo stesso tempo ha suggerito importanti implicazioni sull'origine e sulla evoluzione della vita su questo pianeta.

Quando sintesi e degradazione di un mRNA sono bilanciate, la sua concentrazione rimane in una condizione di stato stazionario. Invece prodotti genici di cui la cellula ha costantemente bisogno possono avere mRNA stabili per molte generazioni cellulari. L'RNA messaggero viene degradato da ribonucleasi presenti in tutti i tipi di cellule. Nelle cellule eucariotiche, le code di poli A in 3' e i cappucci in 5', sono importanti per stabilizzare molti mRNA. La polinucleotide fosforilasi sintetizza polimeri simili all'RNA a sequenza casuale Nel Marianne Grunberg- Manago e Severo Ochoa scoprirono la polinucleotide fosforilasi, un enzima batterico che catalizza la reazione:.

La reazione catalizzata dalla polinucleotide fosforilasi differisce. La reazione procede con qualunque dei quattro nucleosidi difosfato, e la composizione in basi del polimero sintetizzato riflette soltanto le concentrazioni relative dei substrati nel mezzo.

I polimeri di RNA sintetizzati con la polinucleotide fosforilasi sono stati essenziali per definire il codice genetico per gli amminoacidi.

Questa alterazione locale impedisce il movimento della polimerasi lungo lo stampo. Il fungo Amanita Phalloides ha evoluto un meccanismo molto efficace di difesa contro i predatori. Classicamente un gene era definito come la porzione di un cromosoma che determina o influenza la comparsa di un singolo carattere o fenotipo caratteristica reversibile , come per esempio il colore degli occhi.

Una definizione molecolare fu proposta nel Oltre ai geni il DNA contiene anche altri segmenti o sequenze che hanno funzioni regolatrici. Queste sequenze regolatrici sono i segnali che indicano l'inizio o la fine dei geni, che influenzano la trascrizione dei geni, oppure fungono da inizio della replicazione o della ricombinazione.

Alcuni geni possono essere espressi in vari modi per generare prodotti genici multipli a partire da un solo segmento di DNA. Una catena polipeptidica con residui amminoacidici una catena di dimensioni medie corrisponde infatti a coppie di basi bp. Quanti sono i geni presenti in un singolo cromosoma? Tra gli eucarioti, i circa 3,1 miliardi di coppie di basi contenute nel genoma umano codificano quasi 29 geni suddivisi in 24 cromosomi diversi.

Batteri Una singola cellula di E. Il cromosoma di una cellula di E. Questi elementi extracromosomici sono chiamati plasmidi. I plasmidi contengono informazioni genetiche e si replicano per dare origine a plasmidi figli, che vengono trasmessi alle cellule figlie al momento della divisione cellulare.

Oltre che nei batteri i plasmidi sono stati ritrovati nei lieviti e nei funghi. In molti casi i plasmidi non conferiscono alcun vantaggio al loro ospite e la loro unica funzione sembra essere l'autopropagazione. Tuttavia, alcuni contengono geni che rendono il batterio ospite resistente ad agenti antibatterici.

Questi plasmidi e altri simili possono anche passare da una cellula antibiotico-resistente a una antibiotico-sensibile della stessa o di un'altra specie batterica, rendendo quindi quest'ultima resistente. Per ragioni simili, si cerca oggi di limitare l'aggiunta di antibiotici al mangime animale.

Una cellula somatica umana, per esempio, ha 46 cromosomi. Ogni cromosoma di una cellula eucariotica contiene una sola, grande molecola di DNA a doppia catena. Ogni diverso cromosoma eucariotico contiene un insieme caratteristico di geni.

Un corpo umano adulto contiene approssimativamente 10 14 cellule, e quindi la lunghezza totale del DNA corrisponde a circa 2 x km. Se si paragona questa lunghezza a quella della circonferenza della Terra 4 x km o alla distanza. Le cellule eucariotiche sono anche provviste di organelli, mitocondri e cloroplasti, che contengono DNA. In pochi organismi tripanosomi, per esempio ogni mitocondrio contiene centinaia di copie di mtDNA organizzato in complessi e interconnesso alla matrice; queste strutture sono dette chinetoplasti.

I geni e i cromosomi degli eucarioti sono molto complessi: Molti batteri contengono soltanto un cromosoma per cellula e in quasi tutti i casi ogni cromosoma contiene una sola copia di ciascun gene. Solo pochissimi geni, per esempio quelli che codificano l' RNA, sono ripetuti diverse volte. Inoltre quasi tutti i geni sono colineari con la sequenza amminoacidica o con la sequenza di RNA che essi codificano.

Gli studi sui cromosomi eucariotici hanno portato a molte scoperte sorprendenti. Questi inserti non tradotti interrompono la relazione altrimenti colineare tra la sequenza dei nucleoticli del gene e la sequenza amminoacidica del polipeptide. Sono stati isolati e studiati i centromeri di Saccharomyces cerevisiae. I telomeri di lievito terminano con sequenze ripetute nella forma di.

Le sequenze telomeriche ripetute sono aggiunte ai cromosomi eucariotici principalmente dall'enzima specifico telomerasi. Sono stati costruiti cromosomi artificiali come strumento per conoscere meglio il significato funzionale di molte caratteristiche strutturali dei cromosomi eucariotici.

I cromosorri artificiali di lievito YAC sono stati creati come strumento di ricerca biotecnologica. Analogamente, i cromosomi artificiali umani HAC sono stati creati per il trattamento di malattie genetiche mediante la terapia genica. Struttura, organizzazione e funzione del DNA nei vari organismi superavvolgimenti, topoisomeri, nucleosomi Superavvolgimento del DNA: Dagli esempi forniti in precedenza risulta chiaro che il DNA cellulare deve essere strettamente compattato, il che implica un elevato grado di organizzazione strutturale.

Il meccanismo di ripiegamento non deve soltanto impacchettare il DNA, ma deve anche permettere l'accesso all'informazione contenuta nel DNA. La torsione che spesso si verifica in tale filo a partire dalla base dell'apparecchio telefonico al ricevitore generalmente determina un suporavvolgimento.

Un ulteriore ripiegamento o una torsione di tale asse su se stesso determinano un superavvolgimenro del DNA. La replicazione e la trascrizione richiedono una temporanea separazione delle eliche di DNA, resa difficile dal fatto che le due catene del DNA sono avvolte l'una sull'altra. Nel caso del DNA, continue deformazioni comprendono modificazioni conformazionali dovute a movimenti termici o a interazioni con proteine o con altre molecole.

Deformazioni discontinue richiedono la rottura delle catene del DNA. Tuttavia, quando sono purificati, i DNA circolari chiusi sono raramente rilassati, indipendentemente dalla loro origine biologica. In altre parole, il DNA presenta un numero di giri di elica minore di quanto ci si dovrebbe attendere se il DNA fosse nella struttura B.

Un segmento di 84 coppie di basi di un DNA circolare rilassato conterrebbe otto giri di doppia elica, uno per ogni 10,5 coppie di basi. In linea di principio la deformazione potrebbe essere riequilibrata anche tramite la parziale separazione delle due catene di DNA per una lunghezza corrispondente a circa 10 coppie di basi. Le cellule mantengono il DNA in uno stato parzialmente disavvolto per facilitarne il compattamento.

Cominciamo analizzando la separazione delle due catene di un DNA circolare a doppia elica. Ad ogni modo i numeri di legame negativi non si incontrano mai nel DNA cellulare. Possiamo ora estendere questi concetti a un DNA circolare chiuso con coppie di basi. Questa modificazione on ha effetto sul numero di coppie di basi e sul numero di atomi della molecola di DNA circolare. Tw e Wr non sono necessariamente numeri interi.

Queste variazioni strutturali sono di importanza fisiologica minore, ma aiutano a illustrare gli effetti del disavvolgimento. Un DNA cruciforme in genere contiene alcune basi spaiate; il parziale disavvolgimento del DNA contribuisce a mantenere la necessaria separazione delle catene. Questi enzimi svolgono un ruolo importante specialmente in processi quali la replicazione e l'impacchetamento del DNA. Gli effetti di questi enzimi possono essere identificati usando l'elettroforesi su gel di agarosio.

Vi sono almeno quattro diverse topoisomerasi in E. Le forme appartenenti al tipo I topoisomerasi l e III generalmente rilassano il DNA rimuovendo i superavvolgimenti negativi esse aumentano il valore di Lk. Per portare a termine il suo compito tale enzima utilizza l'energia dell'ATP. Per alterare il numero di legame, le topoisomerasi di tipo II tagliano entrambe le catene della molecola di DNA e consentono il passaggio di un altro duplex attraverso la rottura. Anche le cellule eucariotiche possiedono topoisomerasi di tipo I e II.

Gli archea hanno anche un enzima particolare, la topoisomerasi VI, che da sola definisce la famiglia IIB. Le topoisomerasi eucariotiche di tipo II non possono disavvolgere parzialmente il DNA introducendo superavvolgimenti negativi , ma possono rilassare superavvolgimenti sia negativi, sia positivi. Le topoisomerasi svolgono un ruolo importante in ogni aspetto del metabolismo del DNA.

Di conseguenza, esse sono importasti bersagli per il trattamento di infezioni batteriche e del cancro. La compattezza del DNA richiede una speciale forma di superavvolgimento: Le molecole di DNA superavvolto sono uniformi sotto molti punti di vista. I superavvolgimenti sono destrorsi in una molecola di DNA con superavvolgimento negativo; il DNA superavvolto tende anche ad essere lungo e stretto piuttosto che compatto, e spesso possiede ramificazioni multiple.

Sebbene le loro strutture siano significativamente differenti, i superavvolgimenti plectonemico e a solenoide rappresentano due forme di superavvolgimento negativo che possono essere assunte dallo stesso segmento di DNA parzialmente disavvolto. Le due forme sono rapidamente interconvertibili. Essa fornisce un grado molto superiore di compattezza e permette di spiegare come il parziale disavvolgimento contribuisca alla compattezza del DNA.

Struttura dei cromosomi: Il termine "cromosoma" indica una molecola di acido nucleico depositaria dell'informazione genetica di un virus, di un batterio, di una cellula eucariotica o di un organello. Nella cromatina si trovano anche molte proteine non istoniche, alcune delle quali regolano l'espressione di specifici geni.

Ora ci occuperemo della descrizione di questa struttura negli eucarioti e la confronteremo con l'organizzazione del DNA nelle cellule batteriche. Gli istoni sono piccole proteine basiche: Gli istoni sono proteine con masse molecolari comprese tra e presenti nella cromatina di tutte le cellule eucariotiche. Questi polipeptidi sono molto ricchi degli amminoacidi basici arginina e Iisina nell'insieme, rappresentano circa un quarto dei residui amminoacidici.

In tutte le cellule eucariotiche sono presenti le cinque classi principali di istoni, con massa molecolare e composizione amminoacidica diversa. Gli istoni H1, H2A e H2B presentano un grado minore di omologia di sequenza tra le diverse specie eucariotiche. Queste forme di istoni svolgono ruoli particolari nel metabolismo del DNA. Questa compattazione richiede diversi livelli di ripiegamento altamente organizzato.

I granuli disposti "a collana" sono complessi di istoni e DNA. Quando la cromatina viene trattata per breve tempo con enzimi che digeriscono il DNA, viene degradato di preferenza il DNA di collegamento, liberando in tal modo particelle istoniche che contengono coppie di basi che sono state protette dalla digestione.

I nucleosomi isolati ottenuti in questo modo sono stati cristallizzati e studiati per mezzo della diffrazione dei raggi X. Lo stretto avvolgimento del DNA attorno agli istoni nelle particelle nucleosomiche richiede la rimozione di circa un giro d'elica dal DNA. Quando il nucleo proteico di un nucleosoma si lega in vitro a un DNA circolare chiuso in forma rilassata, il legame induce un superavvolgimento negativo.

II rilassamento della superelica positiva non legata lascia intatta la superelica negativa grazie al legame con il centro istonico del nucleosoma e determina una riduzione netta del numero di legame. Le topoisomerasi, si sono dimostrate capaci di indurre l'organizzazione della cromatina in vitra, a partire da istoni purificati e DNA circolare chiuso.

Il nucleo istonico non si lega casualmente al DNA, ma i nucleosomi tendono a localizzarsi in determinate posizioni. I nucleosomi si legano particolarmente bene a livello di sequenze dove dinucleotidi del tipo AA, AT o TT sono separati da intervalli di 10 bp. In molti organismi alcune proteine si legano a sequenze specifiche del DNA, facilitando la formazione di un nucleosoma in quella regione.

I nucleosomi si formano sul DNA durante la replicazione, o a seguito di processi che richiedono un temporaneo spostamento dei nucleosomi stessi. La formazione di queste strutture sembra avvenire per gradi. Quando occorre assemblare i nucleosorni dopo la riparazione del DNA o dopo altri processi, l'RCAF viene sostituito da altre proteine specializzate. Il compattamento richiede la presenza di una molecola di istone H1 per nucleosoma.

Le fibre di 30 nm, un secondo livello di organizzazione della cromatina, forniscono al DNA una compateza di circa volte. Le regioni associate a tale impalcatura sono separate da anse di DNA contenenti probabilmente da a coppie di basi. Per esempio, in Drosophila, una famiglia completa di geni che codificano istoni si presenta raggruppata in anse che sono fissate da siti di attacco all'impalcatura.

La presenza della topoisomerasi II sottolinea ulteriormente l'importarza del rapporto tra il disavvolgimento del DNA e l'assemblaggio della cromatina. Molti farmaci utilizzati nella chemioterapia del cancro sono inibitori della topoisomerasi II e consentono all'enzima di produrre la rottura della catena ma non di riparare l'interruzione.

Esistono evidenze sperimentali a favore dell'esistenza di ulteriori livelli di organizzazione nei cromosomi eucariotici, ognuno dei quali determina un forte aumento del grado di compattezza.

Ulteriori livelli di compattezza nella struttura della cromatina variano probabilmente da cromosoma a cromosoma, da una regione all'altra in un singolo cromosoma e da un istante all'altro nella vita della cellula.

Le proteine sono normalmente dimeriche e creano un complesso a forma di V che si genera dall'interazione tra i due domini a cerniera. Le proteine della famiglia SMC si trovano in tutti i tipi di organismi, dai batteri all'uomo.

I due tipi principali negli eucanoti sono le coesine e le condensine; entrambe sono legate a proteine regolatrici ed accessorie. Le coesine giocano un ruolo essenziale nel legare i cromatidi fratelli immediatamente dopo la replicazione e li tengono uniti quando i cromosomi condensano nella metafase. Le coesine, insieme ad una terza proteina, la cleisina, possono formare un anello interno ai cromosomi replicati che li tiene uniti fino a che la divisione cellulare non richiede la loro separazione.

Le condensine sono essenziali per la condensazione dei cromosomi quando le cellule entrano in mitosi, In laboratorio, le condensine si legano al DNA creando superavvolgimenti positivi; la condensina quindi provoca un superavvolgimento del DNA contrario al disavvolgimento indotto dal legame dei nucleosomi. Le coesine e le condensine sono fondamentali per quelle modificazioni nella struttura del cromosoma che accompagnano il ciclo cellulare degli eucarioti.

I domini sono sottoposti ad una tensione topologica. I domini non hanno una posizione fissa, ma sono in costante movimento lungo il DNA, in coordinazione con la replicazione del DNA. Il DNA batterico non sembra possedere alcuna struttura con un'organizzazione comparabile a quella dei nucleosomi degli eucarioti.

Proteine simili agli istoni sono presenti in abbondanza in E. Gli elevati livelli di metabolismo della cellula battetica stanno a significare che una frazione molto maggiore del DNA viene trascritta o replicata in un dato momento rispetto a quanto accade nella maggior parte delle cellule eucariotiche.

Introni ed esoni I segmenti di DNA non tradotto presenti nei geni sono chiamati sequenze intercalate o introni, mentre i segmenti tradotti sono chiamati esoni.

Solo pochi geni di procarioti contengono introni. I geni per gli istoni sembra non possiedano introni. Dato il numero relativamente basso dei geni nel genoma umano, la funzione di un gran parte del DNA resta inspiegata. Gli elementi trasponibili trasposoni sono una forma di parassiti molecolari, capaci di installarsi con successo all'interno del genoma ospite.

Molti possiedono geni che codificano proteine che catalizzano il processo di trasposizione. Alcuni trasposoni nel genoma umano sono attivi, muovendosi a bassa frequenza, ma per la maggior parte sono stati resi inattivi da mutazioni avvenute durante il corso dell'evoluzione.

Le discussioni vertevano soprattutto sul concetto di stampo, una struttura che doveva permettere alle molecole di allinearsi in un ordine specifico, e di unirsi tra loro per creare una macromolecola con un'unica sequenza e un'unica funzione. L'ipotesi della replicazione semiconservativa fu proposta da Watson e Crick subito dopo la pubblicazione del loro lavoro sulla struttura del DNA nel , e la teoria fu in seguito dimostrata da ingegnosi esperimenti progettati da Matthew Meselson e Franklin Stahl nel Meselson e Stahl coltivarono cellule di E.

Le cellule di E. Il DNA isolato da questa prima generazione di cellule formava una singola banda nel gradiente di CsCl, indicando che le molecole di DNA a doppia elica delle cellule figlie erano ibridi contenenti una catena 14N nuova e una catena 15N parentale. Questo risultato deponeva contro la replicazione conservativa, un'ipotesi alternativa in cui una molecola di DNA figlia sarebbe formata da due catene neosintetizzate e l'altra conterrebbe le due catene parentali; in questo caso non ci sarebbero state molecole ibride nell'esperimento di Meselson-Stahl.

L'ipotesi della replicazione semiconservativa fu ulteriormente rafforzata nella seconda parte dell'esperimento. Le cellule vennero fatte dividere nuovamente in un terreno contenente 14N.

La replicazione inizia in un sito d'origine e procede in entrambe le direzioni In seguito alla conferma del meccanismo semiconservativo sorsero alcune domande. Le catene di DNA parentale si disavvolgono completamente prima che ciascuna si replichi? La replicazione inizia in un punto qualunque o in un sito ben preciso? Dopo l'inizio in un punto sul DNA, la replicazione procede in una o in entrambe le direzioni? Egli rese radioattivo il DNA delle cellule di E. Quando il DNA veniva isolato, disperso ed esposto ad una lastra fotografica per alcune settimane, i residui di timidina radioattiva generavano dei "tracciati" di granuli d'argento, riproducendo l'immagine della molecola di DNA.

Questi tracciati rivelarono che il cromosoma intatto di E. Cairns concluse che l'ansa di DNA risultava dalla formazione di due catene figlie radioattive, ciascuna complementare a una delle catene parentali. L'esperimento di Cairns ha dimostrato che entrambe le catene del DNA vengono replicate simultaneamente, e una variante dello stesso esperimento ha.

Per determinare se le anse originavano da un punto preciso del DNA erano necessari punti di riferimento nella molecola del DNA. Tali punti di riferimento furono individuati grazie a una tecnica chiamata mappatura della denaturazione, sviluppata da Ross Inman e collaboratori. Quando DNA isolati, contenenti anse di replicazione, vengono parzialmente denaturati in questo modo, la posizione e l'avanzamento delle forcelle di replicazione possono essere misurati e mappati usando le regioni denaturate come punti di riferimento.

Questa tecnica ha rivelato che le anse di replicazione iniziano sempre in un punto preciso, chiamato origine. Nel caso di un DNA circolare, le due forcelle di replicazione si muovono in verssi opposti e al termine del processo di rincontrano.

Questo problema fu risolto da Reiji Okazaki e collaboratori negli anni ' La conclusione finale di questo lavoro fu che una catena viene sintetizzata in modo continuo e l'altra in modo discontinuo. Come vedremo, le sintesi della catena veloce e di quella lenta sono strettamente coordinate.

Ogni cellula contiene diversi tipi di nucleasi, che si possono dividere in due classi: esonucleasi ed endonucleasi. Solo poche esonucleasi ed endonucleasi degradano soltanto DNA a catena singola. Nella reazione si libera pirofosfato inorganico. La reazione sembra procedere con soltanto una piccola variazione di energia libera, dato che la formazione di un legame fosfodiestere avviene a spese di un legame fosfoanidride un po' meno stabile. Comunque, le interazioni non covalenti che si instaurano nell'impilamento e nell'appaiamento delle basi aiutano a stabiIizzare maggiormente la catena di DNA che si.

Gli studi iniziali sulla DNA polimerasi l portarono ben presto alla definizione di due condizioni essenziali per la polimerizzazione del DNA. Innanzitutto, tutte le DNA polimerasi necessitano di uno stampo. Dopo l'aggiunta di un nucleotide alla catena di DNA nascente, la DNA polimerasi deve dissociarsi o muoversi lungo lo stampo e aggiungere un altro nucleotide.

Nel caso del cromosoma di E. La DNA polimerasi I ha un sito attivo nel quale entrano solo coppie di basi con questa geometria.

Accurate misurazioni effettuate in vitro hanno dimostrato che le DNA polimerasi inseriscono un nudeotide sbagliato ogni nucleotidi inseriti. Tali errori talvolta si verificano in quanto i nucleotidi si presentano per breve tempo in una forma tautomerica insolita, che permette la formazione di legami idrogeno con una base normalmente non complementare.

La frequenza di errori viene ulteriormente ridotta in vivo da altri meccanismi enzimatici. Queste misure hanno dimostrato che il processo di proofreading migliora la precisione della reazione di polimerizzazione di un fattore di 10 Nella DNA polimerasi I monomerica i siti attivi per la polimerizzazione e per il proofreading sono separati anche se si trovano sullo stesso polipeptide.

Quando si combinano i processi di proofreading e di selezione delle basi, una DNA polimerasi commette circa un errore ogni coppie di basi. Tuttavia la precisione della replicazione delle cellule di E. Un ulteriore sistema enzimatico ripara i rimanenti errori nell'appaiamento delle basi a replicazione avvenuta. Prenderemo ora in considerazione le classi principali di enzimi della replicazione in base ai problemi che essi devono affrontare. La separazione delle catene provoca una tensione topologica nella struttura ad elica del DNA, che viene rimossa dall'azione delle topoisomerasi.

Le catene separate vengono stabilizzate da proteine che legano il DNA. Prima dell'inizio della sintesi del DNA devono essere presenti o venire sintetizzati i primer, che sono in genere brevi frammenti di RNA sintetizzati da enzimi chiamati primasi. Queste interruzioni nick devono essere riparate da enzimi denominati DNA ligasi. Tutti questi processi devono essere coordinati e regolati. Le interazioni tra questi e altri enzimi sono state meglio caratterizzate in E. La replicazione del cromosoma di E.

Nei prossimi due capitoli vedremo che le sintesi degli altri principali polimeri biologici, gli RNA e le proteine, possono essere suddivise nelle stessi tre fasi, ciascuna con caratteristiche peculiari. I risultati descritti qui di seguito derivano soprattutto da esperimenti in vitro effettuati con proteine purificate da E. Inizio L'origine della replicazione in E. Queste proteine sono componenti necessari essenziali nelle reazioni di ricombinazione, i loro nomi riflettono i loro ruoli.

Un'altra proteina che si lega al DNA, l'HU una proteina batterica simile agli istoni, originariamente denominata fattore U , pur partecipando al processo non sembra avere uno specifico sito di legame. Alla fase di inizio della replicazione partecipano almeno 10 differenti enzimi o proteine. Essi aprono l'elica del DNA all'origine e formano un complesso preprimer per le successive reazioni.

Questa idrolisi dell'ATP agisce come un interruttore che media l'interconversione della proteina in due stadi. Otto molecole proteiche di DnaA nello stato conformazionale indotto dal legame dell'ATP si uniscono e formano un complesso che comprende i siti R ed I dell'oriC. Lo stretto avvolgimento destrorso del DNA attorno a questo complesso introduce un superavvolgimento positivo. Le elicasi DnaB posizionate intorno alle due catene di DNA si muovono quindi in direzioni opposte, creando due potenziali forcelle di replicazione.

Tutte le altre proteine della forcella di replicazione sono direttamente o indirettamente legate alla DnaB. Appena comincia la replicazione e le due catene di DNA si separano a livello della forcella, le catene separate sono stabilizzate dal legame di molte molecole di proteine che si uniscono al DNA a singola catena SSB , mentre la DNA girasi la DNA topoisomerasi II rilascia lo stress topologico prodotto davanti alla forcella dalla reazione di disavvolgimento. La regolazione avviene solo una volta in ogni ciclo cellulare.

La regione oriC di E. In seguito l'oriC si stacca dalla membrana plasmatica, SeqA si dissocia, e il DNA deve essere completamente metilato dalla metilasi Dam prima che possa ancora legarsi alla DnaA e iniziare un nuovo ciclo di replicazione. Allungamento La fase di allungamento della replicazione consta di due eventi apparentemente simili, ma ben distinti per quanto riguarda il meccanismo: la sintesi della catena veloce e la sintesi della catena lenta.

Vari enzimi presenti alla forcella di replicazione sono importanti per la sintesi di entrambe le catene. La sintesi della catena veloce comincia con la sintesi da parte di una primasi la proteina DnaG di un breve primer di RNA da la a 60 nucleotidi all'origine della replicazione.

La proteina DnaG interagisce con l'elicasi DnaB per catalizzare la reazione, e il primer viene sintetizzato in direzione opposta a quella con cui si sposta la DnaB elicasi. Infatti, la DNA elicasi si muove lungo la catena che diventa la catena lenta nella sintesi del DNA; tuttavia, il primo primer sintetizzato dalla prima interazione DnaG-DnaB serve per innescare la sintesi della catena veloce di DNA nella direzione opposta. La sintesi della catena veloce procede in modo continuo, in sincronia con il disavvolgimento del DNA a livello della forcella di replicazione.

La difficolta sta nel coordinamento della sintesi della catena veloce e della catena lenta: entrambe le catene sono prodotte da un singolo dimero asimmetrico di DNA polimerasi III, che viene coordinato facendo piegare ad anello il DNA della catena lenta e procedendo insieme nei due diversi percorsi di polimerizzazione La sintesi dei frammenti di Okazaki sulla catena lenta comporta un'elegante coreografia enzimatica. La DNA polimerasi III utilizza uno dei dimeri del nucleo per sintetizzare la catena veloce in maniera continuativa; l'altro dimero sintetizza un frammento di Okazaki dopo l'altro sull'anello che si forma sulla catena lenta.

L'elica lenta col primer passa all'interno dell'anello attraverso l'apertura. L'interruzione che rimane viene ricucita dalla DNA ligasi. Il gruppo fosforico deve essere attivato tramite adenililazione. Terminazione Normalmente le due forcelle di replicazione del cromosoma circolare di E. La sequenza Ter funziona come sito di legame per una proteina chiamata Tus acronimo per terminus utilization substance. Solo un complesso Tus-Ter funziona per ogni ciclo di replicazione; si tratta di quello che viene incontrato per primo da una delle due forcelle.

Dato che le forcelle di replicazione oppste in genere si fermano quando si incontrano, non sembra che le sequenze Ter svolgano un molo essenziale: ma potrebbero comunque impedire l'ulteriore replicazione da parte di una forcela nel caso che l'altra venisse ritardata o fermata da ostacoli o danneggiamenti del DNA.

I DNA circolari legati in questo modo vengono chiamati catenani e in E. Le caratteristiche essenziali della replicazione del DNA sono le stesse in eucarioti e procarioti, e molti dei complessi proteici sono funzionalmente e strutturalmente conservati. Accede gratis a la descarga de miles de libros y ebooks en pdf, epub y mobi.

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